Etapa I

In prima etapă a proiectului se urmăreste validarea ansamblului în conditii de laborator si demonstrarea faptului că toate componentele ansamblului fluxului tehnologic functionează corect ca sistem. P1 a dezvoltat o tehnologie validată (TRL4) pentru fluxul de sinteză –caracterizare–încărcare–eliberare controlată a compusilor bioactivi, a MCM41, cu sau fără încap-sulare în matrice polimerică biocompatibilă. Această tehnologie a fost pusă la punct pe baza unei noi metode de sinteză a MCM41. Astfel s-a redus spectaculos pretului produsului zeolitic final, comparativ cu metodele anterioare de sinteză utilizate. Experienta echipei de cercetare UPB-CO în dezvoltarea acestei tehnologii se bazează pe cercetările din cadrul proiectului POSCCE 02.1.2, „Noi materiale din clasa aluminosilicatilor mezoporosi pentru eliberare controlată de substante biologic active”, finalizat în anul 2014, în care s-a dezvoltat tehnologia (la nivel TRL4) de sinteză a MCM41 pornind de la tetraetil ortosilicat ca precursor, folosind drept compusi biologic activi antibiotice din clasa cefalosporinelor. Acest proiect propune o abordare complet diferită, folosind alt precursor mult mai ieftin – trisilicat, alte clase de compusi încărcati, o nouă metodă de încapsulare în material polimeric biocompatibil si de incarcare a acestuia cu biocompusi. Elementele majore de noutate sunt: o metodă nouă (mult mai ieftină), validată de sinteză a MCM41; metode noi, validate, de încărcare a compusilor bioactivi în matricea zeolitică; metode noi, validate, de caracterizare a materialelor prin FT-IR si DLS; o metodă nouă, validată, de încapsulare a materialului zeolitic încărcat cu compus bioactiv, în matrice chitosan; metode noi, validate, de studiu a eliberării controlate a compusilor bioactivi din compozitele zeolit-chitosan. Astfel, se consideră că tehnologia de obtinere a compozitelor zeolit – chitosan demonstrează un grad de maturitate corespunzător (TRL4) pentru ridicarea la scară. TRL5 pentru tehnologia de obtinere a compozitelor zeolit-chitosan. Acestui nivel de maturitate tehnologică vizează finalul etapei I a proiectului, prin optimizari pentru cresterea fidelitătii testelor de laborator în raport cu sistemul real. Pe lângă studiul detaliat al parametrilor de validare, etapele de verificare a robustetii includ studiul variabilelor majore ale fluxului tehnologic pentru evaluarea sistemului în conditii reale de exploatare. Atingerea TRL5 este în deplină concordantă cu logica derulării primei etape a proiectului, bazată pe maturitatea tehnologiei existente (TRL4), si are ca scop atingerea tuturor obiectivelor premergătoare realizării prototipului.

schemabth2.jpg

In prima etapa a proiectului s-au realizat activitatile necesare indeplinirii obiectivelor etapei si anume optimizarea tehnologiilor de obtinere a prototipului inovativ zeolit MCM41-chitosan-principii active prin aplicarea tehnologiei de nivel TLR4 pentru obtinerea zeolitului MCM41-chitosan, precum si integrarea tehnologiei TLR4 de obtinere a compusilor bioactivi in sistemul zeolitic pentru aplicatiile propuse – terapia anti-acneica si a plagilor cronice. Matricea zeolitica MCM41 s-a obtinut printr-o tehnologie de sinteză care utilizeaza trisilicat ca precursor, mult mai ieftin decat tetraetil ortosilicatul (TEOS) folosit in mod current, imbunatatind astfel raportul calitate/pret pentru produsul MCM41. De asemenea, s-a realizat si incapsularea zeolitului in chitosan, precum si incarcarea acestui complex cu principii active. Toti acesti produsi si intermediari au fost caracterizati in detaliu prin metode analitice validate.

In acelasi timp, valorificarea biotehnologica a resurselor vegetale s-a realizat prin tehnici extractive si de purificare ce presupun prelucrarea acestora in vederea optimizarii randamentului de extractie a principiilor active. Acestea directioneaza procesele de obtinere a extractelor vegetale catre anumiti compusi bioactivi (terpene, saponine, flavone, polizaharide, salicilati, etc), de interes pentru aplicatiile terapeutice propuse. Astfel, s-au extras si caracterizat prin metode analitice principii active din 6 surse vegetale reprezentand plantele propuse pentru aplicatiile in terapia plagilor cronice (PPC) si a acneei vulgaris (PA).

 

Principalele etape de desfasurare a activitatilor vizate in prima faza a proiectului:

  1. Aplicarea tehnologiei de nivel TRL 4 pentru obtinerea zeolitului MCM41-chitosan in sistem functionalizat
  2. Solutii tehnologice pentru validarea la nivel laborator a principiilor active:
  • Justificarea plantelor utilizate in aplicatiile propuse: s-au identificat 6 resurse vegetale pentru aplicatiile in terapia plagilor cronice (PPC) si a acneei vulgaris (PA): Salvia officinalis (salvia) datorita efectelor antimicrobiene, anti-inflamatoare, regeneratoare tisulare atribuite compusilor triterpenici; Calendula officinalis (galbenele) – activitate de vindecare a ranilor, efect antiinflamator, actiune antimicrobiana, in principal, prin compusii triterpenici si flavonoide; Salix alba (cortex) – salcie – contine salicina, cel mai activ compus antiinflamator din salcie; Mentha spicata (menta) – actiune antibacteriana, antifungica, antioxidanta prin componentele uleiului volatil; Echinacea purpurea (echinaceea) – efecte bacteriostatice, de vindecare/ cicatrizare a ranilor, anti-inflamator datorita alkamidelor prezente in extractul din echinaceea; Matricaria chamomila (musetelul) – actiune anti-inflamatoare prin chamazulene. Concluzie: Avand in vedere beneficiile mentionate mai sus, extractele de salvie, galbenele, echinaceea si musetel au fost propuse pentru terapia plagilor cronice, iar extractele de salvie, galbenele, echinaceea, coaja de salcie si menta au fost propuse pentru tratmentul acneei vulgaris.
  • Metode analitice de caracterizare a extractelor vegetale:

In scopul validarii extractelor, acestea au fost caracterizate prin diferite metode analitice:

  • Determinarea continutului de substanta uscata/substante extractibile
  • Determinarea spectrofotometrica continutului de polifenoli totali exprimati in acid cafeic in extractele alcoolice
  • Determinarea spectrofotometrica a continutului de proantociani in extractele alcoolice
  • Determinarea cantitativa spectrofotometrica a flavonoidelor totale in extractele alcoolice
  • Determinarea semicantitativa a acidului ursolic in extractul alcoolic din Salviae officinalis folium prin metoda HPTLC
  • Identificarea HPTLC a derivatilor acidului salicilic in Extractul alcoolic din Salicis cortex
  • Identificarea prin cromatografie pe strat subtire a compusilor fenolici din diferite extracte alcoolice
  • Identificarea compusilor prezenti in extractele vegetale prin GC-MS
  1. Functionalitatea sistemului MCM41-chitosan:

Pornind de la avantajele majore ale utilizării compuşilor biologic activi de origine naturală în tratarea acneei şi a plăgilor cronice, s-au căutat soluţii tehnice avantajoase pentru materiale suport şi variante de încapsulare ce permit eliberarea lentă a compuşilor de interes, pentru a asigura o acţiune susţinută a acestora, precum şi un raport de adsorbţie compus activ / suport, cât mai ridicat. Soluţia propusă vizează utilizarea MCM41 ca suport cu capacitate de încărcare foarte mare (suprafaţă specifică ce depăşeşte 900m2/g pentru materialele comerciale) şi chitosan pentru încapsularea finală. Avantajele utilizării chitosanului în tratarea plăgilor sunt binecunoscute, acesta asigurând o acţiune sinergică în raport cu compuşii bioactivi utilizaţi. De asemenea, chitosanul asigură o capacitate de încărcare suplimentară a suportului, precum şi capacitatea de permeabilizare selectivă, în mediu slab acid, a suprafeţei de încapsulare. Suplimentar, adsorbţia de compuşi bioactivi pe suprafaţa exterioara polară de chitosan, permite o desorbţie rapidă a acestei fracţii, respectiv o acţiune imediată în momentul aplicării. Ca urmare, prototipul propus este multifuncţional: va asigura o acţiune rapidă la momentul aplicării, o acţiune susţinută prin desorbţia lentă, o eliberare controlată de pH-ul mediului, precum şi o acţiune sinergică a chitosanului.

Procesul tehnologic propus implică sinteza MCM41, purificarea acestuia, adsorbţia compuşilor bioactivi, urmată de încapsularea în chitosan, conform schemei de flux tehnologic. Procesul cuprinde două etape de reacţie în care intervin materiile prime 1-7, etape intermediare de pregătire a reactanţilor, omogenizare, precipitare, spălare, filtrare, uscare, calcinare, şi conduce, pe lângă produsul finit, la reziduuri solide, ape reziduale şi gaze/vapori; fiind identificate 5 puncte critice şi 3 puncte critice de control, în vederea ţinerii sub control a riscurilor fizice, chimice şi microbiologice. Pentru întregul flux tehnologic se utilizează o cantitate mare de apă – MP7, a cărei puritate se va situa în clasa de apă ultrapură.

  1. Proiectare model preclinic:

         3.1. Model dermatita bacteriana: evaluarea actiunii produsului de testat a infectiei cu Propionumbacterium acnes se va efectua pe un model animal.

         3.2. Model inducere diabet zaharat la sobolani: pentru o testare corespunzatoare a efectului cicatrizant si epitelizant al produsului am ales un model animal, care presupune inducerea diabetului zaharat la sobolan.

 

  1. Integrarea tehnologiei de nivel TRL4 de obtinere a compusilor bioactivi in sistemul zeolitic pentru aplicabilitate in terapia anti-acneica si a plagilor cronice
  2. Exploatarea resursei vegetale validata la nivel de laborator pentru aplicatiile mentionate

Pentru obtinerea principiilor active sub forma de extracte alcoolice tip tincturi la nivel laborator s-a utilizat o metoda combinata tinand cont de avantajele/dezavantajele diferitelor procedee, de echipamentele din dotarea laboratorului de cercetare precum si din sectia de productie. Plantele au fost recoltate si uscate in conditii corespunzatoare. Extractele alcoolice au fost caracterizate analitic prin dozarea reziduului la evaporare (substanta uscata g/100 mL), dozarea spectrofotometrica a unui principiu activ ce se presupune a fi cu activitate biologica: acid ursolic, hiperozida, proantociani, polifenoli, flavonoide, precum si identificarea prin cromatografie HPTLC a altor componente: rutin, acid clorogenic, derivati ai acidului salicilic, acid rosmarinic, eriotricine si acid cafeic.

  1. Analize comparative ale prototipului proiectat fata de zeolitii naturali si MCM41 de pe piata pentru evidentierea superioritatii calitate/pret

În urma analizei bilanţului masic s-au estimat costurile materialelor intermediare şi al produsului final, fiind realizată analiza comparativă a prototipului proiectat faţă de zeoliţi naturali şi MCM41 de pe piaţă pentru evidenţierea superiorităţii raportului calitate / preţ. Se constată că nivelul costurilor calculate pentru materialul final (MCM41 ar include numai aprox. 60% din costuri) este de cel puţin 10 ori mai scăzut, comparativ cu MCM41 comercial, iar achiziţia materiilor prime în cantităţi mari va reduce, de asemenea costurile cu 10-15%. În privinţa zeoliţilor naturali, a fost folosit pentru comparaţie Montmorillonit, un zeolit cu capacitate detoxifiantă ridicată. Deşi preţul produsului este redus, suprafaţa specifica (200 m2/g comparativ cu 1200 m2/g), omogenitatea şi structura microporoasă reprezintă dezavantaje funcţionale majore, discutate anterior.

Concluziile primei etape a proiectului:

Obiectivele etapei au fost indeplinite in totalitate si s-au concretizat in:

  • studiul funcţionalităţii sistemului zeolit MCM41-chitosan;
  • analiza comparativă a prototipului proiectat faţă de zeoliţi naturali şi MCM41 de pe piaţă pentru evidenţierea superiorităţii raportului calitate / preţ a soluţiei tehnice implementate;
  • elaborarea protocoalelor de lucru pentru instalaţia de laborator TRL4, pentru prototip şi pentru analizele de laborator;
  • elaborarea protocoalelor de lucru pentru validare;
  • teste funcţionale preliminare folosind instalaţia de laborator (la nivel TRL4), obţinerea de date analitice prin metodele DLS şi FT-IR, elaborarea buletinelor de analiză.