Raport FINAL

RAPORT FINAL

 

PROTOTIP DE PRODUSE MEDICAMENTOASE CU ELIBERARE CONTROLATA PE BAZA DE COMPOZITE CHITOSAN-ZEOLIT

 

         REZUMAT

Proiectul consta in obtinerea unui prototip pentru doua produse medicamentoase/ dispozitive medicale cu administrare topica, ce combina proprietatile unor materiale inovatoare pe baza de zeolit si chitosan cu principii active vegetale cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) si a acneei vulgaris (PA). Complexitatea algoritmului de studii chimico-farmaceutice, tehnologice, biotehnologice, cu proiectie in inovatia de produs farmaceutic, cu rapoarte calitate/ pret si eficacitate/ toxicitate superioare celor din piata a necesitat un parteneriat multidisciplinar dintre un IMM (CO) care desfasoara activitati de cercetare avansata in stiinta medicamentului, interesat in asimilarea de rezultate si tehnologii transferabile in fabricatia de farmaceutice si doua universitati recunoscute pentru supraspecializari si experienta in domeniul chimiei aplicate si stiintei materialelor, UPB (P1) si respectiv farmaceutic si medical, UMF Craiova (P2).

Componentele prototipului obtinute prin tehnologii avansate validate in laborator (TRL4) au fost dezvoltate/ optimizate si ridicate la un nivel operational superior (TRL6), de obtinere la scara pilot in cadrul unui laborator nou infiintat de catre partenerul industrial (CO). Demonstrarea functionalitatii prototipului in conditii relevante de exploatare (TRL6) s-a concretizat in validarea intregului sistem operational la scara reala. Prototipul validat a fost testat pe modele preclinice pentru a demonstra actiunea biologica si eficienta in conditii de functionare similare celor reale. Maturitatea tehnologiei TRL6 a fost demonstrata prin obtinerea unor profile de desorbtie lenta a principiilor active din matricea zeolit-chitosan fiind indeplinit astfel criteriul de baza al functionalitatii prototipului de produse in conditii de exploatare farmaceutica. Obtinerea acestui prototip inovativ la scara pilot deschide o arie vasta de oportunitati de valorificare in domeniul medical si farmaceutic.

Finalul proiectului conchide validarea prototipului pentru produs terapeutic concretizat in obtinerea PA si PPC cu efecte dovedite in conditii operationale direct implementabile ulterior in aplicatii reale. Sistemul operational TRL6 va permite validarea prototipului într-un mediu de testare industrial, în conditii reale de exploatare. 

Scopul proiectului consta in realizarea unui prototip pentru doua produse medicamentoase/ dispozitive medicale cu administrare topica, ce combina proprietatile unor materiale inovatoare pe baza de zeolit si chitosan cu principii active vegetale cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) si a acneei vulgaris (PA). Componentele prototipului sunt obtinute prin tehnologii avansate validate in laborator (TRL4), in cadrul proiectului urmand a fi dezvoltate si ridicate la scara la un nivel operational superior (TRL6). Prototipul validat va fi testat pe modele preclinice pentru a demonstra actiunea biologica si eficienta in conditii de functionare similare celor reale. Complexitatea algoritmului de studii chimico-farmaceutice, tehnologice, biotehnologice, cu proiectie in inovatia de produs farmaceutic, cu rapoarte calitate/pret si eficacitate/toxicitate superioare celor din piata, necesita un parteneriat multidisciplinar dintre un IMM (CO) care desfasoara activitati de cercetare avansata in stiinta medicamentului, interesat in asimilarea de rezultate si tehnologii transferabile in fabricatia de farmaceutice si doua universitati recunoscute pentru supraspecializari si experienta in domeniul chimiei aplicate si stiintei materialelor, UPB (P1) si respectiv farmaceutic si medical, UMF Craiova (P2).

Obiectivele proiectului se incadreaza in schema urmatoare si contin procese tehnologice inovative care conduc la realizarea unui prototip pentru produs terapeutic cu cedare lenta si sustinuta a principiului activ :

Picture1

  1. Avansarea tehnologiilor validate in laborator (TRL4) de obtinere a componentelor zeolit si biocomplex pentru configurarea sistemului si trecerea catre TRL 5

Proiectul porneste pe baza celor 2 componente validate in laborator TRL 4. Zeolitul sintetic MCM41 se sintetizeaza pe baza unei tehnologii inovative validate, cu un cost mai scazut, plecand de la trisilicat. Acesta va fi caracterizat ca structura si distributie granulometrică în diferite etape de procesare (DLS), urmand a fi apoi utilizat ca baza pentru principiile active (Schema flux tehnologic). Compusii biologic activi rezulta din materii prime vegetale din surse proprii, sunt caracterizati prin specificatii tehnice si standardizati in: triterpene, polizaharide, polifenoli, compusi fenolici si flavonoide in functie sursa. Efectele biocompusilor se vor realiza pe modele in vitro in vederea testarii a) toxicitatii pe celule umane (fibroblasti HS-27) pentru a demonstra conformitatea din punct de vedere al efectului citotoxic; b) efectului antimicrobian pe tulpini relevante de microorganisme; c) in vitro a mecanismului de actiune utilizand liniile celulare de fibroblasti (HS-27) si keratinocite (HaCaT) tratate cu amestecul de principii active – proliferarea (ciclu celular prin citometrie de flux), viteza de migrare, stresul oxidativ (evaluarea O2 si a H2O2 prin citometrie de flux). Potentialul anti-inflamator va fi evaluat prin cuantificarea citokinelor IL-6 si IL-8 (citometrie de flux), activitatea metaloproteazelor MMP2 si 9 (zimografie), nivelurile Cox2 qRT-PCR. Rezultatele acestor teste vor sta la baza formularii compozitiilor optime de principii active in scopul maximizarii efectelor biologice.

  1. Realizarea complexului zeolit-principii active-chitosan-principii active. Cuplarea principiilor active cu matricea de zeolit, incapsularea complexului zeolit MCM41-biocompusi in chitosan si reincarcarea complexului nou format cu principii active se vor realiza prin tehnologii noi validate, pentru a conferi o incarcatura activa sustinuta pentru aplicatiile propuse. Acest grup structural va fi caracterizat prin metode validare noi d.p.d.v. al eliberarii controlate a compusilor bioactivi prin teste trans-dermice (celula Franz), profile de desorbtie si analiza FT-IR in diferite medii sintetice care mimeaza fluidele naturale. Se vor relua aceleasi analize in vitro care s-au efectuat pentru caracterizarea biocomplexelor in scopul evidentierii efectului antimicrobian, lipsei de toxicitate si a mecanismelor de actiune.
  2. Ridicarea la scara a prototipului si testarea in conditii reale de exploatare a efectului de produs valorificabil in industria farmaceutica. Prototipul se va realiza intr-o instalatie de nivel pilot in cadrul CO cu optimizarea parametrilor tehnologici transferati de la nivelul de laborator in vederea obtinerii unor conditii relevante functionale. Testarea preclinica a produselor prototip se va efectua utilizand modele corespunzatoare aplicatiilor tintite. Astfel, pentru prototipul de produs PPC destinat terapiei plagilor cronice se va realiza un model animal care presupune inducerea diabetului zaharat la sobolan, prin administrarea intravenoasa a substantei alloxan. Se vor urmari reepitelizarea, evolutia leucocitelor polimorfonucleare, fibroblastelor, vaselor de neoformatie, colagenului nou format comparative cu rezultatele obtinute in urma studierii vindecarii cutanate la sobolani din lotul de control. Pentru testarea efectului antiacneic, produsul prototip PA va fi aplicat pe un model animal de acnee obtinut prin injectarea intradermica de Propionibacterium acnes la sobolan. Finalul proiectului va fi concretizat prin validarea prototipului pentru produs terapeutic concretizat in obtinerea PA si PPC cu efecte in vivo dovedite in conditii operationale direct implementabile ulterior in aplicatii reale.

Gradul de atingere a rezultatelor estimate in cadrul proiectului:

În prima etapă a proiectului s-a efectuat validarea ansamblului în conditii de laborator si demonstrarea faptului că toate componentele ansamblului fluxului tehnologic functionează corect ca sistem. P1 a dezvoltat o tehnologie validată (TRL4) pentru fluxul de sinteză –caracterizare–încărcare–eliberare controlată a compusilor bioactivi, a MCM41, cu sau fără încap-sulare în matrice polimerică biocompatibilă. Această tehnologie a fost pusă la punct pe baza unei noi metode de sinteză a MCM41. Astfel s-a redus spectaculos pretului produsului zeolitic final, comparativ cu metodele anterioare de sinteză utilizate. Experienta echipei de cercetare UPB-CO în dezvoltarea acestei tehnologii se bazează pe cercetările din cadrul proiectului POSCCE 02.1.2, „Noi materiale din clasa aluminosilicatilor mezoporosi pentru eliberare controlată de substante biologic active”, finalizat în anul 2014, în care s-a dezvoltat tehnologia (la nivel TRL4) de sinteză a MCM41 pornind de la tetraetil ortosilicat ca precursor, folosind drept compusi biologic activi antibiotice din clasa cefalosporinelor. Acest proiect propune o abordare complet diferită, folosind alt precursor mult mai ieftin – trisilicat, alte clase de compusi încărcati, o nouă metodă de încapsulare în material polimeric biocompatibil si de incarcare a acestuia cu biocompusi. Elementele majore de noutate sunt: o metodă nouă (mult mai ieftină), validată de sinteză a MCM41; metode noi, validate, de încărcare a compusilor bioactivi în matricea zeolitică; metode noi, validate, de caracterizare a materialelor prin FT-IR si DLS; o metodă nouă, validată, de încapsulare a materialului zeolitic încărcat cu compus bioactiv, în matrice chitosan; metode noi, validate, de studiu a eliberării controlate a compusilor bioactivi din compozitele zeolit-chitosan. Astfel, se consideră că tehnologia de obtinere a compozitelor zeolit – chitosan demonstrează un grad de maturitate corespunzător (TRL4) pentru ridicarea la scară. TRL5 pentru tehnologia de obtinere a compozitelor zeolit-chitosan. Acestui nivel de maturitate tehnologică vizează finalul etapei I a proiectului, prin optimizari pentru cresterea fidelitătii testelor de laborator în raport cu sistemul real. Pe lângă studiul detaliat al parametrilor de validare, etapele de verificare a robustetii includ studiul variabilelor majore ale fluxului tehnologic pentru evaluarea sistemului în conditii reale de exploatare. Atingerea TRL5 este în deplină concordantă cu logica derulării primei etape a proiectului, bazată pe maturitatea tehnologiei existente (TRL4), si are ca scop atingerea tuturor obiectivelor premergătoare realizării prototipului.

In prima etapa a proiectului s-au realizat activitatile necesare indeplinirii obiectivelor etapei si anume optimizarea tehnologiilor de obtinere a prototipului inovativ zeolit MCM41-chitosan-principii active prin aplicarea tehnologiei de nivel TLR4 pentru obtinerea zeolitului MCM41-chitosan, precum si integrarea tehnologiei TLR4 de obtinere a compusilor bioactivi in sistemul zeolitic pentru aplicatiile propuse – terapia anti-acneica si a plagilor cronice. Matricea zeolitica MCM41 s-a obtinut printr-o tehnologie de sinteză care utilizeaza trisilicat ca precursor, mult mai ieftin decat tetraetil ortosilicatul (TEOS) folosit in mod current, imbunatatind astfel raportul calitate/pret pentru produsul MCM41. De asemenea, s-a realizat si incapsularea zeolitului in chitosan, precum si incarcarea acestui complex cu principii active. Toti acesti produsi si intermediari au fost caracterizati in detaliu prin metode analitice validate.

In acelasi timp, valorificarea biotehnologica a resurselor vegetale s-a realizat prin tehnici extractive si de purificare ce presupun prelucrarea acestora in vederea optimizarii randamentului de extractie a principiilor active. Acestea directioneaza procesele de obtinere a extractelor vegetale catre anumiti compusi bioactivi (terpene, saponine, flavone, polizaharide, salicilati, etc), de interes pentru aplicatiile terapeutice propuse. Astfel, s-au extras si caracterizat prin metode analitice principii active din 6 surse vegetale reprezentand plantele propuse pentru aplicatiile in terapia plagilor cronice (PPC) si a acneei vulgaris (PA).

Principalele rezultate obtinute in prima faza a proiectului:

  1. Aplicarea tehnologiei de nivel TRL 4 pentru obtinerea zeolitului MCM41-chitosan in sistem functionalizat
  2. Solutii tehnologice pentru validarea la nivel laborator a principiilor active:
  • Justificarea plantelor utilizate in aplicatiile propuse: s-au identificat 6 resurse vegetale pentru aplicatiile in terapia plagilor cronice (PPC) si a acneei vulgaris (PA): Salvia officinalis (salvia; Calendula officinalis (galbenele); Salix alba (cortex); Mentha spicata (menta; Echinacea purpurea (echinaceea); Matricaria chamomila (musetelul). Extractele de salvie, galbenele, echinaceea si musetel au fost propuse pentru terapia plagilor cronice, iar extractele de salvie, galbenele, echinaceea, coaja de salcie si menta au fost propuse pentru tratamentul acneei vulgaris.
  • Metode analitice de caracterizare a extractelor vegetale:

In scopul validarii extractelor, acestea au fost caracterizate prin diferite metode analitice: metode identificare, spectrofotometrice, metode HPTLC, GC-MS.

  1. Functionalitatea sistemului MCM41-chitosan:

Pornind de la avantajele majore ale utilizării compuşilor biologic activi de origine naturală în tratarea acneei şi a plăgilor cronice, s-au căutat soluţii tehnice avantajoase pentru materiale suport şi variante de încapsulare ce permit eliberarea lentă a compuşilor de interes, pentru a asigura o acţiune susţinută a acestora, precum şi un raport de adsorbţie compus activ / suport, cât mai ridicat. Soluţia propusă vizează utilizarea MCM41 ca suport cu capacitate de încărcare foarte mare (suprafaţă specifică ce depăşeşte 900m2/g pentru materialele comerciale) şi chitosan pentru încapsularea finală. Suplimentar, adsorbţia de compuşi bioactivi pe suprafaţa exterioara polară de chitosan, permite o desorbţie rapidă a acestei fracţii, respectiv o acţiune imediată în momentul aplicării. Ca urmare, prototipul propus este multifuncţional: va asigura o acţiune rapidă la momentul aplicării, o acţiune susţinută prin desorbţia lentă, o eliberare controlată de pH-ul mediului, precum şi o acţiune sinergică a chitosanului.

Procesul tehnologic propus implică sinteza MCM41, purificarea acestuia, adsorbţia compuşilor bioactivi, urmată de încapsularea în chitosan, conform schemei de flux tehnologic. Procesul cuprinde două etape de reacţie în care intervin materiile prime 1-7, etape intermediare de pregătire a reactanţilor, omogenizare, precipitare, spălare, filtrare, uscare, calcinare, şi conduce, pe lângă produsul finit, la reziduuri solide, ape reziduale şi gaze/vapori; fiind identificate 5 puncte critice şi 3 puncte critice de control, în vederea ţinerii sub control a riscurilor fizice, chimice şi microbiologice.

  1. Proiectare model preclinic:

         3.1. Model dermatita bacteriana: evaluarea actiunii produsului de testat a infectiei cu Propionumbacterium acnes se va efectua pe un model animal.

         3.2. Model inducere diabet zaharat la sobolani: pentru o testare corespunzatoare a efectului cicatrizant si epitelizant al produsului s-a ales un model animal, care presupune inducerea diabetului zaharat la sobolan.

  1. Integrarea tehnologiei de nivel TRL4 de obtinere a compusilor bioactivi in sistemul zeolitic pentru aplicabilitate in terapia anti-acneica si a plagilor cronice
  2. Exploatarea resursei vegetale validata la nivel de laborator pentru aplicatiile mentionate

Pentru obtinerea principiilor active sub forma de extracte alcoolice tip tincturi la nivel laborator s-a utilizat o metoda combinata tinand cont de avantajele/dezavantajele diferitelor procedee, de echipamentele din dotarea laboratorului de cercetare precum si din sectia de productie.

  1. Analize comparative ale prototipului proiectat fata de zeolitii naturali si MCM41 de pe piata pentru evidentierea superioritatii calitate/pret

În urma analizei bilanţului masic s-au estimat costurile materialelor intermediare şi al produsului final, fiind realizată analiza comparativă a prototipului proiectat faţă de zeoliţi naturali şi MCM41 de pe piaţă pentru evidenţierea superiorităţii raportului calitate / preţ. Se constată că nivelul costurilor calculate pentru materialul final (MCM41 ar include numai aprox. 60% din costuri) este de cel puţin 10 ori mai scăzut, comparativ cu MCM41 comercial, iar achiziţia materiilor prime în cantităţi mari va reduce, de asemenea costurile cu 10-15%.

In a doua etapa a proiectului s-a testat toxicitatea si actiunea compusilor biologic activi prin experimente in vitro si s-a stabilit compozitia eficace necesara aplicatiilor terapeutice tintite. In scopul optimizarii potentialului terapeutic al grupului structural zeolit MCM41-chitosan-principii active, s-au obtinut extracte vegetale cu continut standardizat si inalt purificat in componente active (CAT2–extract uscat frunze de Salvia officinalis). In plus fata de extractele obtinute in prima etapa de cercetare industriala, s-au aplicat solutii tehnologice suplimentare la nivel de laborator pentru exploatarea de noi resurse vegetale in scopul completarii spectrului de actiuni biologice cu aplicatii in patologiile propuse. Uleiul de catina, extras din fructele de Hippophae rhamnoides a fost introdus in studiu datorita continutului bogat in principii active valoroase pentru functia de regenerare tisulara. Formula optima pentru sustinerea eficacitatii grupului structural inovativ cuprinde 5 extracte vegetale: CAT2-extract uscat din frunze de Salvia officinalis; extract hidroalcoolic 65% de Calendula officinalis flos – galbenele; extract hidroalcoolic 70% de Matricariae chamomilla flos- musetel; extract hidroalcoolic 70% din Mentha spicata –menta; ulei din fructe de Hippophae rhamnoides. Matricea zeolitica MCM41-sinteza s-a obtinut prin optimizarea tehnologiei de nivel TLR4 si prin aplicarea de metodologii de investigare critica a caracteristicilor specifice materialului mezoporos pe baza de siliciu. Complexul integrat MCM41 sinteza-extract vegetal-chitosan s-a realizat prin abordarea de solutii tehnologice optimizate si validate. Stabilirea design-ului prototipului s-a concretizat in baza investigatiilor riguroase efectuate pentru complexul integrat inovativ zeolit MCM41 -chitosan-principii active, la nivelul sistemului biologic, in vitro si in vivo. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) s-a definit prin completarea actiunilor biologice ale grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-catina-chitosan. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) s-a proiectat prin combinatia optima a grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-menta-chitosan si MCM-41-musetel-chitosan. Prototipurile de produs au fost supuse evaluarii eficacitatii profilului de cedare lenta si sustinuta a principiilor active din matricea zeolit-chitosan  prin aplicarea de metodologii si tehnologii high-tech. Configuratia finala a prototipului de produs a fost riguros caracterizata fizico-chimic si microbiologic si validata pe fluxul tehnologic de sinteza si cuplare cu principiile active si chitosan in scopul obtinerii unui material standardizat calitativ si cantitativ, ieftin si reproductibil pentru a fi ulterior transferat la nivel pilot prin ridicarea la scara a tehnologiilor de sinteza.

Principalele rezultate obtinute in faza a doua a proiectului:

  1. Studii de fezabilitate pentru cercetare industriala
  2. Testarea eficientei compusilor biologic activi si formularea compozitiilor optime pentru maximizarea efectelor biologice:
    • Investigarea critica a potentialului principiilor active extrase din resurse vegetale:

Efectele biocompusilor activi au fost investigate pe modele in vitro in vederea testarii: a) toxicitatii pe linii de celule umane standardizate, derivate din piele (HS-27 fibroblasti dermali si HaCaT keratinocite epidermale) pentru a identifica intervalul de doze citotoxice si pragul de raspuns viabil la nivel celular; b) in vitro a mecanismului de actiune a principiilor active – proliferativ; antioxidant; anti-inflamator.

2.2. Formularea compozitiilor optime pentru maximizarea efectelor biologice:

In baza investigatiilor critice ale potentialului principiilor active in vitro si in vivo s-au stabilit urmatoarele compozitii optime pentru: aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) s-a definit complexul de principii active prin completarea actiunilor biologice ale extractului uscat de salvie CAT2, extractului hidroalcoolic de galbenele, uleiului de catina; aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) s-a proiectat panelul de efecte prin combinatia optima a extractului uscat de salvie CAT2, extractului hidroalcoolic de galbenele, extractului hidroalcoolic de menta si extractului hidroalcoolic de musetel.

  1. Testarea si optimizarea cuplarii principiilor biologic active cu matricea de zeolit-chitosan:

3.1. Studii tehnologice preliminare de obtinere a structurii mezoporoase caracteristice MCM-41 pe baza de silice

3.2. Reevaluare schemei de flux și a parametrilor procesului tehnologic:

Procesul tehnologic propus pentru obținerea materialelor încărcate și încapsulate (MIICa – Calendula, MIISa – Salvia, MIIHp -Hyppophae, MIIMh -Mentha, MIIMc- Matricaria) implică sinteza MCM41, purificarea acestuia, adsorbția compușilor bioactivi, urmată de încapsularea în chitosan, conform schemei de flux prezentate. În această etapă a fost reevaluată schema de flux, în vederea eliminării etapelor redundante, ca urmare a experiențelor de optimizare ale proceselor ce conduc la produsul final.

 

  1. Investigatie critica a profilului de actiune specifica in vitro a prototipului de produs, inclusiv toxicitate si testarea potentialului de interactiune la nivelul sistemului biologic

4.1. Investigatie critica a activitatii biologice a produselor prin experimente in vitro si testarea eficacitatii interactiunii la nivelul sistemului biologic: In urma procesului de optimizare a cuplarii principiilor biologic active cu matricea de zeolit-chitosan s-au obtinut urmatoarele 5 grupuri structurale: MCM-41-CAT2-chitosan; MCM-41-galbenele-chitosan; MCM-41-musetel-chitosan; MCM-41-menta-chitosan; MCM-41-catina-chitosan. Actiunea in vitro a grupurilor structurale a fost investigata pe modele experimentale specifice in vederea testarii: a) toxicitatii pe linii de celule umane – materialele cu extracte vegetale incarcate pe matricea zeolit-chitosan la concentratiile testate nu manifesta citotoxicitate ; b) in vitro a mecanismului de actiune a principiilor active – s-a demonstrat efectul proliferativ; antioxidant; anti-inflamator celular si molecular prin reducerea de citokine pro-inflamatorii IL-6 si IL-8, activarea metaloproteinazele MMP-2 si MMP-9 (zimografie) si scaderea nivelurilor de COX2 prin RT-PCR; activarea vitezei de migrare a celulelor dermice si epidermice c) efect antimicrobian pe tulpini relevante in terapeutica afectiunilor acneice cutanate: Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa;

4.2. Testarea eficacitatii la nivelul sistemului biologic prin aplicarea de modele preclinice:  pentru investigarea efectului biologic in vivo s-au efectuat studii preliminare (model CAM de oua embrionate, model plagi cronice si model acnee).

5.Stabilirea designului prototipului. Evaluarea cedarii lente a principiilor active din sistem in diferite medii sintetice prin test de performanta in vitro

  • Stabilirea designului prototipului:

Stabilirea design-ului prototipului s-a concretizat in baza investigatiilor riguroase efectuate pentru complexul integrat inovativ zeolit MCM41 -chitosan-principii active, la nivelul sistemului biologic, in vitro si in vivo. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) s-a definit prin completarea actiunilor biologice ale grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-catina-chitosan. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) s-a proiectat prin combinatia optima a grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-menta-chitosan si MCM-41-musetel-chitosan.

  • Evaluarea cedarii lente a principiilor active din sistem in diferite medii sintetice prin test de performanta in vitro – sistem de difuzie verticala:

Pentru testarea cedarii lente a principiilor active din matricea zeolit-chitosan prin sistemul de difuzie verticala s-a conditionat prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC sub forma de gel. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) sub forma de masca. Rezultatele obtinute indica un profil de desorbtie a principiilor active lent si sustinut pe o perioada lunga de timp (48h).

  • Caracterizare fizico-chimica a prototipului si configuratie finala a prototipului

Caracterizarea fizico-chimică a prototipului:

Caracterizarea fizico-chimică a prototipului în variantele PPC și PA, a fost realizată atât prin metode clasice, cât și prin metode avansate spectrometrice și de imaging, în vederea obținerii unor informații relevante privind proprietățile acestuia: analize EDS, TEM, SEM, FT-IR, BET, ICP-OES, AAS, GC-MS – HS, HPLC, LC-MS-MS.

Configurație finală a prototipului:

Configuratia finala a prototipului de produs a fost riguros caracterizata fizico-chimic si microbiologic si validata pe fluxul tehnologic de sinteza si cuplare cu principiile active si chitosan in scopul obtinerii unui material standardizat calitativ si cantitativ, ieftin si reproductibil pentru a fi ulterior transferat la nivel pilot prin ridicarea la scara a tehnologiilor de sinteza.

In a treia etapa a proiectului s-au desfasurat etapele de ridicare la scara a prototipului si testarea in conditii reale de exploatare a efectului de produs valorificabil in industria farmaceutica. Prototipul pentru cele doua produse de uz topic s-a realizat pe o instalatie automatizata de nivel pilot in cadrul CO cu optimizarea parametrilor tehnologici transferati de la nivelul de laborator in vederea obtinerii unor conditii relevante functionale. S-a implementat TRL6 pentru tehnologia de obtinere a prototipului la scară reală de catre CO, cu experientă până la TRL9,  punand in aplicare capacitatea institutională si mediul de testare high-tech pentru realizarea si validarea prototipului, respectiv obtinerea prototipului final. Transferul tehnologic la TRL6 a presupus rezolvarea tuturor detaliilor tehnice si tehnologice care au avut ca rezultat definitivarea unei instalatii de sinteza a materialului mezoporos pe baza de silice MCM-41 cu elemente automatizate ce permite obținerea unui volum semnificativ mai mare de produs comparativ cu instalația de laborator, precum si stabilirea schemei fluxului tehnologic în urma analizei datelor de optimizare a procesului de obținere a prototipului pentru cele doua produse topice PA și PPC si ale datelor de bilanț masic. Ridicarea la scara a tehnologiilor de obtinere a prototipurilor la nivel pilot a implicat definirea si caracterizarea parametrilor tehnologici pentru exploatarea în condiții de siguranță a tuturor instalațiilor din fluxul tehnologic, respectiv stabilirea, in cadrul CO, a locației laboratorului de cercetare-dezvoltare pentru compozite mezoporoase și analiza caracteristicilor acesteia; corelarea schemelor de flux tehnologic cu schema de amplasare a tuturor instalațiilor din fluxul tehnologic din cadrul laboratorului de cercetare-dezvoltare, nou infiintat in cadrul CO, pentru compozite mezoporoase; si achizitionarea de catre CO a mobilierului, consumabilelor, reactivilor si aparaturii high-tech specifică pentru prelucrarea materialelor în diferite etape de obtinere. Transferul de cunostinte si date tehnologice catre agentul economic CO s-a derulat in corelatie cu obiectivele acestei etape a proiectului si a constat in transferul procedurilor de lucru pentru implementarea sistemului de management al calității pentru obținerea PA și PPC, transferul fluxurilor de lucru si transferul de cunoștințe privind programul de validare și de întocmire a specificațiilor tehnice ale PA și PPC, în condiții reale de exploatare tehnologica. Pentru ridicara la scara pilot a tehnologiilor de obtinere a prototipurilor a fost necesara ca etapa precursoare validarea sistemului de exploatare a resursei vegetale la nivel pilot pentru fabricatia de compusi bioactivi, astfel s-au obtinut, in cantitati corespunzatoare ridicarii la scara pilot a prototipurilor, si s-au caracterizat in conformitate cu Farmacopeea Europeana (FE) si ghidurilor farmaceutice (Ghidul de Buna Practica de Fabricatie Farmaceutica, ICH Q7a  si PIC – Pharmaceutical Inspections Convention) extractul hidroalcoolic 65% de Calendula officinalis flos– galbenele; extractul hidroalcoolic 70% de Matricariae chamomilla flos- musetel si extractul hidroalcoolic 70% din Mentha spicata –menta. CAT2-extract uscat din frunze de Salvia officinalis a fost obtinut in etapa a doua a proiectului, la o marime a seriei adecvata transferului tehnologic la nivel pilot, conform procesului de fabricatie, descris in etapa anterioara, ce indeplineste toate criteriile de admisibilitate impuse de legislatia farmaceutica. Uleiul din fructe de Hippophae rhamnoides (catina) a fost achizitionat de la producator extern (SCM Chimica Bistrita) si caracterizat fizico-chimic si microbiologic de catre CO in conformitate cu Farmacopeea Europeana.

Exploatarea maximizata a tuturor elementelor de transfer tehnologic s-a concretizat in validarea intregului sistem tehnologic de obtinere la scara pilot a prototipurilor PA si PPC prin: sinteza materialului mezoporos pe baza de silice MCM-41, fabricatia extractelor vegetale hidroalcoolice, obtinerea materialului MCM-41 incarcat cu extracte vegetale si chitosan, definitivarea proiectelor de specificatie tehnica, sinteza prototipului PPC- pulbere pentru uz topic si a materialului precursor (materie prima-pulbere) fabricatiei prototipului PA, caracterizarea materialelor sintetizate, fabricatia prototipului PA (masca-gel pentru terapia acneei) si caracterizarea fizico-chimica si microbiologica conform FE.

Demonstrarea maturitatii tehnologiei TRL6 de obtinere a prototipurilor PA si PPC in conditii reale de exploatare a efectului de produs valorificabil in domeniu farmaceutic s-a efectuat prin evaluarea pe modele de testare preclinica (in vitro si in vivo) a actiunii biologice cicatrizanta, regeneranta, anti-microbiana si anti-inflamatoare, precum si prin algoritmul proceselor de adsorbtie si desorbtie a prototipurilor ca element cheie al eficacitatii terapeutice.

Finalul proiectului conchide validarea prototipului pentru produs terapeutic concretizat in obtinerea PA si PPC cu efecte biologice dovedite in conditii operationale direct implementabile ulterior in aplicatii reale.

Rezultatele obtinute in cadrul proiectului au fost diseminate prin publicarea de articole, prezentarea de lucrari la congrese si conferinte, organizarea de workshop (poze atasate) si protejarea dreptului de proprietate intelectuala prin depunerea unei cereri de brevet.

 

Prezentarea si argumentarea nivelului de maturitate tehnologica (TRL) la finalul proiectului

Scopul proiectului a fost indeplinit integral prin parcurgerea etapizata a proceselor metodologice si tehnologice de dezvoltare/optimizare si ridicare la scara prin validare la un nivel operational superior (TRL6) a componentelor prototipului obtinut prin tehnologii avansate validate in laborator (TRL4).

Ridicarea la scara a tehnologiilor de obtinere a prototipurilor PA si PPC la nivel pilot (TRL6) a fost definitivata integral prin executarea si validarea operatiilor:

  • Optimizarea procesului de obtinere a prototipurilor PA si PPC in conformitate cu caracteristicile specifice materialelor mezoporoase pe baza de silice.
  • Definitivarea schemei fluxului tehnologic în urma analizei datelor de optimizare a procesului de obținere a PA și PPC, a datelor de bilanț masic privitoare la ridicarea la scară, precum și prin minimizarea etapelor intermediare redundante care nu afectează caracteristicile produselor finale:

Procesul tehnologic pentru obținerea materialelor încărcate și încapsulate (MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc) implică sinteza MCM41, purificarea acestuia, adsorbția compușilor bioactivi în gradient de concentrație și încapsularea în chitosan (o singură etapă ce permite introducerea secvențială a componentelor, precum și uscarea finală a produsului), conform schemei de flux prezentate.

Picture1

Schema de flux pentru procesul tehnologic de obținere a prototipului în variantele PPC și PA, din materialele încărcate și încapsulate (MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc

  • Definitivarea instalației în flux continuu pentru obținerea MCM41 (ridicarea la scară a instalației de laborator), care include elemente de automatizare (comandată prin calculator) și permite obținerea unui volum semnificativ mai mare de produs comparativ cu instalația de laborator, a unei reproductibilități mult mai bune, precum și monitorizarea etapelor de lucru urmate de utilizator.
  • Caracterizarea parametrilor tehnologici pentru exploatarea în condiții de siguranță a tuturor instalațiilor din fluxul tehnologic si infiintarea unui nou Laborator de cercetare-dezvoltare de catre CO (poze atasate):
  • stabilirea locației laboratorului de cercetare-dezvoltare pentru compozite mezoporoase și analiza caracteristicilor acesteia;
  • corelarea schemelor de flux SCF-1 și SCF-2 cu schema de amplasare a tuturor instalațiilor din fluxul tehnologic din cadrul laboratorului de cercetare-dezvoltare pentru compozite mezoporoase;
  • separarea (în spațiu și timp, după caz) a tuturor operațiilor ce vizează producția PA și PPC (categoria DO) de toate operațiile ce vizează controlul de calitate (categoria DA și DV);
  • eliminarea tuturor încrucișărilor de flux prin redirecționarea sau programarea corespunzătoare a operațiilor, revizuirea fluxurilor de lucru în formatul final;
  • actualizarea elementelor de bilanț masic pentru volumul de PA și PPC și corelarea elementelor de bilanț masic cu parametrii funcționali ai instalației de sinteză a MCM41 – morfologie sferică și control dimensional;
  • achizitionarea de catre CO, in conformitate cu schema fluxului tehnologic, a mobilierului, consumabilelor, reactivilor si aparaturii specifice pentru ridicarea la scara reala
  • Definitivarea și documentarea tuturor etapelor de lucru pentru obținerea prototipurilor PA și PPC în condiții normale de exploatare ale instalațiilor din fluxul tehnologic, la partenerul industrial; Programul de validare și întocmirea specificațiilor tehnice ale PA și PPC;
  • Exploatarea la scara reala a resurselor vegetale pentru obtinerea de extracte hidroalcoolice ca material intermediar in sinteza la nivel pilot a prototipurilor PA si PPC;
  • Executarea si validarea etapelor de sinteza la scara pilot, in cadrul laboratorului nou infiintat de CO, a materialului mezoporos pe baza de silice MCM-41, a materialelor intermediare si a prototipurilor PA si PPC. Caracterizare fizico-chimica si microbiologica. Definirea prototipului PPC valorificabil farmaceutic;
  • Transferul la scară pilot a tehnologiilor de obținere a prototipului PA – configuratie finala a unui produs de uz topic sub forma de masca-gel destinat terapiei acneei

Transferul tehnologic la nivel TRL6 s-a finalizat cu obtinerea de materiale mezoporoase pe baza de silice MCM-41 cu caracteristici structurale si functionale specifice; obtinerea de materiale intermediare: MCM-41-extracte vegetale-chitosan si obtinerea de prototip pentru produs destinat plagilor cronice (PPC) si acneei vulgaris (PA) in conformitate cu specificatia tehnica si prevederile standardelor farmaceutice.

Maturitatea tehnologica (TRL6) a fost validata prin efectul de produs pentru cele doua farmaceutice de uz uman demonstrat prin investigatii biologice in vitro si in vivo cu evidentierea actiunii proliferative, antioxidante, antiinflamatoare la nivel celular si molecular, regeneratoare celulare la un timp prelungit de tratare a celulelor; a efectului antimicrobian si a eficacitatii in vivo pe modele animale destinate pentru terapia plagilor cronice si a acneei vulgaris. Maturitatea tehnologiei TRL6 a fost demonstrata prin obtinerea unor profile de desorbtie lenta a principiilor active din matricea zeolit-chitosan fiind indeplinit astfel criteriul de baza al functionalitatii prototipului de produse in conditii de exploatare farmaceutica.

Demonstrarea functionalitatii prototipului in conditii relevante de exploatare (TRL6) s-a concretizat in validarea intregului sistem operational la scara reala:

  • validarea procesului de obtinere la scara pilot a materialelor mezoporoase pe baza de silice, tip MCM-41, riguros caracterizate fizico-chimic si microbiologic, validarea proceselor de incarcare a extractelor vegetale in matricea zeolit-chitosan, procesul de validare a obtinerii prototipului final (PA si PPC);
  • validarea tehnologiilor de exploatare la scara reala a resurselor vegetale cu obtinerea extractelor hidroalcoolice necesare obtinerii prototipurilor PA si PPC;
  • validarea procesului de fabricatie la scara pilot a prototipului pentru produsul conditionat sub forma de masca-gel si destinat terapiei acneei.

 

Modul de atribuire si exploatare de catre parteneri a drepturilor de proprietate intelectuala asupra rezultatelor proiectului

Rezultatele cercetărilor obţinute in urma derulării prezentului contract de cercetare au condus la depunerea unei cereri de brevet  la OSIM, de catre BIOTEHNOS SA in calitate de solicitant/ titular, conform acordului prealabil al partenerilor.  Prin urmare, in situatia eliberarii brevetului de inventie, Biotehnos, in calitate de titular al brevetului, respectand cerintele legale privind drepturile de proprietate intelectuala prevazute de Legea 83/2014 si a art.75 din OG 57/2002, va decide modul de valorificare si exploatare a invenţiei. Totodata, titularul brevetului va stabili drepturile partenerilor, conform acordului dintre acestia, avand in vedere criterii precum: efectele economice, comerciale şi/sau sociale care decurg din exploatarea invenţiei de către titular sau de către terţi, aportul acestuia la invenţie, amploarea problemei tehnice rezolvată de invenţie, aportul creativ al partenerilor / inventatorilor.

Realizarile economice si/sau tehnologice obtinute la finalul proiectului comparativ cu obiectivele propuse in planul de afaceri

Rezultatele proiectului transferabile către operatorul economic sunt următoarele:

  • prototip PPC pentru produs farmaceutic destinat terapiei plagilor cronice (preparat de uz topic sub formă de pulbere), testat în ceea ce privește eficacitatea în condiții de scara pilot, apropiate de mediul industrial.
  • prototip PA pentru produs farmaceutic destinat terapiei acnnei vulgaris (preparat de uz topic sub formă masca-gel), testat în ceea ce privește eficacitatea în condiții de scara pilot, apropiate de mediul industrial.

Conform asumărilor din Cererea de finanțare, nivelul de maturitate asumat în proiect (TRL4 – TRL6) a fost atins (pentru ambele prototipuri estimăm un nivel TRL 6), prototipurile obținute fiind transferate către aplicatorul BIOTEHNOS S.A. Momentul efectiv al intrării în fabricația de serie este legat de obținerea autorizării în vederea punerii pe piață, conform reglementărilor naționale și europene. Procesul, care implică o serie de studii de stabilitate și intervenția unor organisme de testare și autorizare externe, este estimat la 1-1,5 ani, conform reglementărilor referitoare la produse noi, însă experiența a arătat că depășirea acestor prevederi este un fapt obișnuit, indiferent de cauzele invocate.

Studiile de fezabilitate elaborate pe parcursul derulării proiectului au arătat că estimările făcute în Planul de afaceri atașat Cererii de finanțare rămân valabile, în condițiile în care cererea de produse Bio este în creștere, iar noile direcții de inovare propuse în strategiile referitoare la bioeconomie (http:// www.europarl.europa.eu/ meetdocs /2009_2014/ documents/ com/ comcom(2012)0060_/com_com(2012)0060ro.pdf.) sunt puternic susținute de Comisia Europeană.În aceste condiții indicatorii economici și financiari prevăzuți în Planul de afaceri și reluați în Studiul de fezabilitate rămân valabili pentru perioada următoare.

 

Impactul rezultatelor obtinute in cadrul proiectului

Exploatarea maximizata a tuturor elementelor de transfer tehnologic la nivel de maturitate TRL6 s-a concretizat in validarea intregului sistem tehnologic si metodologic de obtinere la scara pilot a prototipurilor PA si PPC prin: sinteza materialului mezoporos pe baza de silice MCM-41 cu caracteristici structurale si functionale specifice; fabricatia la scara pilot a extractelor vegetale hidroalcoolice, obtinerea materialului intermediar: MCM-41 incarcat cu extracte vegetale si chitosan, definitivarea proiectelor de specificatie tehnica, sinteza si validarea la nivel pilot a prototipului PPC- pulbere pentru uz topic si prototipului PA, caracterizarea fizico-chimica si microbiologica a prototipurilor conform specificatiilor tehnice si FE; validarea fabricatiei la nivel pilot a prototipului PA (masca-gel pentru terapia acneei)

Prototipul inovativ obtinut in cadrul acestui proiect exceleaza prin avantajele majore ale grupurilor structurale componente fata de produsele medicamentoase/ dispozitivele medicale pentru nisa terapeutica tintita. Astfel, inovatia bazata pe obtinerea matricei zeolitice, a tehnologiile de incarcare a principiului activ, a incapsularii in biopolimer si reincarcat cu principiu activ are avantaje semnificative fata de zeolitii naturali/alti zeoliti sintetici, datorita puritatii si omogenitatii ridicate a materialului finit ca urmare a utilizarii precursorilor calitate farmaceutica; capacitatii lor de incarcare mari; structurii lor mezoporoase datorita uniformitatii structurale si a dimensiunilor relativ mari ale porilor care confera posibilitatea depunerii si eliminarii uniforme a medicamentului considerat si a controlului farmacodinamicii principiului activ; structurii cu grupari silanolice cu proprietati higroscopice si adsorbante; capacitatii detoxifiante datorate adsorbtiei compusilor toxici, astfel permitand eliminarea acestora. Tehnologia validata de obtinere a MCM41 confera si avantajul unui pret avantajos al MCM41 in comparatie cu substanta comerciala, lipsei de toxicitate în comparatie cu utilizarea precursorilor clasici organometalici, precum si conditiile blande de sinteza care usureaza tranferul tehnologic. Chitosanul este un biopolimer natural, foarte abundent, ieftin, non-toxic, biocompatibil si biodegradabil, descris ca material perfect pentru tratamentul ranilor datorita proprietatilor sale antibacteriene, hemostatice si mucoadezive, accelerand vindecarea.

Realizarea combinatiei zeolit MCM41-chitosan rezulta intr-un grup structural original care ofera matricea optima pentru incorporarea si eliberarea controlata si sustinuta a principiilor active, conferind in acelasi timp protectia impotriva factorilor mediului in care sunt administrate care ar putea duce la degradarea acestora. Solutia tehnică originala propusa de încărcare suplimentară a chitosanului cu compus bioactiv oferă posibilitatea asigurării rapide a unei concentratii utile în timp scurt, pentru a obtine si un efect terapeutic imediat (sustinut în timp de desorbtia lentă din zeolit).

Aceasta combinatie exceptionala este recomandata in aplicatii medicale, permitand realizarea unor produse inovative, eficiente si unice pe piata interna si internationala. Plagile cronice si acneea vulgaris sunt afectiuni care necesita dezvoltarea de noi terapii. Plagile cronice includ ulcerele varicoase, ranile diabeticilor si escarele Din perspectiva clinica, tratamentul ideal pentru astfel de rani trebuie sa aiba un cost scazut, sa produca un disconfort minim pentru pacient si sa fie usor de aplicat. Pe piata exista putine optiuni care sa indeplineasca toate aceste criterii. Prin efectul de produs demonstrat prin investigatii biologice in vitro si in vivo pentru actiunea proliferativa, antioxidanta, antiinflamatoare la nivel celular si molecular, regeneratoare celular la un timp prelungit de tratament si a efectului antimicrobian se poate conchide indeplinirea tuturor criteriilor de functionalitate a prototipului PPC pentru un produs de uz farmaceutic, ieftin si cu eficacitate sustinuta in timp, pentru care se preconizeaza un impact major in nisa terapeutica tintita.

Strategia de tratament a acneei vulgaris, depinde de severitatea bolii si consta in topice locale, antibiotice orale, retinoizi si hormoni orali. Toate aceste tratamente produc efecte secundare nedorite datorate anti-androgenilor, rezistentei la antibiotice a bacteriilor, precum si efectelor teratogene. Avand in vederea necesitatea gasirii de solutii eficiente fara efecte secundare, in cadrul acestui proiect s-a obtinut un prototip inovativ PA de uz topic sub forma de masca/gel, ce combina actiunea concertata a principiilor active si a complexului zeolit MCM41-chitosan favorizand vindecarea si prin actiunea localizata, evitand efectele unui tratament sistemic.

Fabricarea prototipului la nivel pilot, structurata in 3 etape: selectarea tintei, generarea si optimizarea de noi cai si procese si prenominalizarea medicamentului de uz uman / dispozitiv medical candidat, a permis obtinerea de rezultate pentru o etapa ulterioara, de dezvoltare a produsului prototip (GLP Toxicology Phase and clinical I, II, III). Ansamblul tuturor informatiilor documentate in descoperirea si dezvoltarea produsului prototip vor fi incluse in documentatia de autorizare a produsului pentru introducerea pe piata.

Obtinerea acestui prototip inovativ la scara pilot deschide o plaja vasta de oportunitati de valorificare in domeniul medical si farmaceutic: de la obtinerea de biofilme pe baza de materiale mezoporoase pana la realizarea de medicamente tip depot.

Finalul proiectului conchide validarea prototipului pentru produs terapeutic concretizat in obtinerea PA si PPC cu efecte biologice dovedite in conditii operationale direct implementabile ulterior in aplicatii reale. Sistemul operational TRL6 va permite validarea prototipului într-un mediu de testare industrial, în conditii reale de exploatare.

 

Laborator de cercetare-dezvoltare pentru compozite mezoporoase- nou infiintat de partenerul industrial (CO):

Picture1 Picture2 Picture3 Picture4

 

Diseminare rezultate – organizare workshop:

Picture5 Picture6 Picture7