Select Page

Etapa 2

In a doua etapa a proiectului s-a testat toxicitatea si actiunea compusilor biologic activi prin experimente in vitro si s-a stabilit compozitia eficace necesara aplicatiilor terapeutice tintite. In scopul optimizarii potentialului terapeutic al grupului structural zeolit MCM41-chitosan-principii active, s-au obtinut extracte vegetale cu continut standardizat si inalt purificat in componente active (CAT2–extract uscat frunze de Salvia officinalis), astfel ca prin purificarea, concentrarea si standardizarea extractului in aceste principii active valoroase este maximizata eficienta terapeutica a resursei vegetale, precum si a matricei zeolit MCM41-chitosan-principii active care asigura un rezervor remarcabil si un dispozitiv de eliberare lenta si sustinuta in scopul obtinerii unui efect farmacologic prelungit. In plus fata de extractele obtinute in prima etapa de cercetare industriala, s-au aplicat solutii tehnologice suplimentare la nivel de laborator pentru exploatarea de noi resurse vegetale in scopul completarii spectrului de actiuni biologice cu aplicatii in patologiile propuse. Uleiul de catina, extras din fructele de Hippophae rhamnoides a fost introdus in studiu datorita continutului bogat in principii active valoroase pentru functia de regenerare tisulara. Formula optima pentru sustinerea eficacitatii grupului structural inovativ cuprinde 5 extracte vegetale: CAT2-extract uscat din frunze de Salvia officinalis; extract hidroalcoolic 65% de Calendula officinalis flos – galbenele; extract hidroalcoolic 70% de Matricariae chamomilla flos- musetel; extract hidroalcoolic 70% din Mentha spicata –menta; ulei din fructe de Hippophae rhamnoides.
Matricea zeolitica MCM41-sinteza s-a obtinut prin optimizarea tehnologiei de nivel TLR4 si prin aplicarea de metodologii de investigare critica a caracteristicilor specifice materialului mezoporos pe baza de siliciu. Complexul integrat MCM41 sinteza-extract vegetal-chitosan s-a realizat prin abordarea de solutii tehnologice optimizate si validate. Stabilirea design-ului prototipului s-a concretizat in baza investigatiilor riguroase efectuate pentru complexul integrat inovativ zeolit MCM41 -chitosan-principii active, la nivelul sistemului biologic, in vitro si in vivo. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) s-a definit prin completarea actiunilor biologice ale grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-catina-chitosan. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) s-a proiectat prin combinatia optima a grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-menta-chitosan si MCM-41-musetel-chitosan. Prototipurile de produs au fost supuse evaluarii eficacitatii profilului de cedare lenta si sustinuta a principiilor active din matricea zeolit-chitosan prin aplicarea de metodologii si tehnologii high-tech. Configuratia finala a prototipului de produs a fost riguros caracterizata fizico-chimic si microbiologic si validata pe fluxul tehnologic de sinteza si cuplare cu principiile active si chitosan in scopul obtinerii unui material standardizat calitativ si cantitativ, ieftin si reproductibil pentru a fi ulterior transferat la nivel pilot prin ridicarea la scara a tehnologiilor de sinteza.

Principalele etape de desfasurare a activitatilor vizate in faza a doua a proiectului:
1. Studii de fezabilitate pentru cercetare industriala
2. Testarea eficientei compusilor biologic activi si formularea compozitiilor optime pentru maximizarea efectelor biologice: Valorificarea biotehnologica a resurselor vegetale s-a realizat prin tehnici extractive si de purificare ce presupun prelucrarea acestora in vederea optimizarii randamentului de extractie a principiilor active. Acestea directioneaza procesele de obtinere a extractelor vegetale catre anumiti compusi bioactivi (terpene, saponine, flavone, polizaharide, salicilati, etc), de interes pentru aplicatiile terapeutice propuse.

2.1. Investigarea critica a potentialului principiilor active extrase din resurse vegetale:

Efectele biocompusilor activi au fost investigate pe modele in vitro in vederea testarii: a) toxicitatii pe linii de celule umane standardizate, derivate din piele (HS-27 fibroblasti dermali si HaCaT keratinocite epidermale) pentru a identifica intervalul de doze citotoxice si pragul de raspuns viabil la nivel celular; b) in vitro a mecanismului de actiune a principiilor active – proliferativ prin analiza ciclului celular utilizand citometria in flux; antioxidant prin evaluarea stresului oxidativ: cuantificarea nivelului de radicali liberi (O.2 si H2O2)  produs de celule prin citometrie in flux; anti-inflamator prin masurarea ratei de eliberare extracelulara a citokinelor pro-inflamatorii IL-6 si IL-8.

 

2.2. Formularea compozitiilor optime pentru maximizarea efectelor biologice:

In baza investigatiilor critice ale potentialului principiilor active in vitro si in vivo s-au stabilit urmatoarele compozitii optime pentru: aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) s-a definit complexul de principii active prin completarea actiunilor biologice ale extractului uscat de salvie CAT2, extractului hidroalcoolic de galbenele, uleiului de catina; aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) s-a proiectat panelul de efecte prin combinatia optima a extractului uscat de salvie CAT2, extractului hidroalcoolic de galbenele, extractului hidroalcoolic de menta si extractului hidroalcoolic de musetel.

3. Testarea si optimizarea cuplarii principiilor biologic active cu matricea de zeolit-chitosan:

3.1. Studii tehnologice preliminare de obtinere a structurii mezoporoase caracteristice MCM-41 pe baza de silice

3.2. Reevaluare schemei de flux și a parametrilor procesului tehnologic:     

Procesul tehnologic propus pentru obținerea materialelor încărcate și încapsulate (MIICa – Calendula, MIISa – Salvia, MIIHp -Hyppophae, MIIMh -Mentha, MIIMc- Matricaria) implică sinteza MCM41, purificarea acestuia, adsorbția compușilor bioactivi, urmată de încapsularea în chitosan. În această etapă a fost reevaluată schema de flux, în vederea eliminării etapelor redundante, ca urmare a experiențelor de optimizare ale proceselor ce conduc la produsul final.

 

3.2.1. Optimizarea etapelor de sinteză a materialului MCM-41:

            În cadrul acestei etape, un prim set de experimente s-a realizat în vederea optimizării sintezei MCM41.

3.2.2. Optimizarea etapelor de încărcare și încapsulare:

            Experimentele de optimizare a etapelor de încărcare și încapsulare pentru obținerea MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc au vizat:

  • studiul efectului diluției extractului utilizat pentru încărcare
  • studiul efectului concentrației de chitosan
  • studiul efectului vitezei de evaporare a solvenților (sistem apă – etanol)
  • studiul optimizării contactului între MCM41 și extract
  • studiul efectului timpului de uscare
  • studiul reproductibilității metodei de încărcare și încapsulare și al omogenității produsului final

3.2.3. Optimizarea etapelor de obținere a prototipurilor pentru PPC și PA din materialele încărcate și încapsulate MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc:

            Experimentele de optimizare a etapelor de obținere a PPC și PA din materialele încărcate și încapsulate MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc au vizat:

  • studiul efectului timpului de omogenizare
  • studiul reproductibilității metodei de obținere a PPC și PA din materialele încărcate și încapsulate MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc și al omogenității produsului final

4. Investigatie critica a profilului de actiune specifica in vitro a prototipului de produs, inclusiv toxicitate si testarea potentialului de interactiune la nivelul sistemului biologic

4.1. Investigatie critica a activitatii biologice a produselor prin experimente in vitro si testarea eficacitatii interactiunii la nivelul sistemului biologic:

  In urma procesului de optimizare a cuplarii principiilor biologic active cu matricea de zeolit-chitosan s-au obtinut urmatoarele 5 grupuri structurale: MCM-41-CAT2-chitosan; MCM-41-galbenele-chitosan; MCM-41-musetel-chitosan; MCM-41-menta-chitosan; MCM-41-catina-chitosan.

Actiunea in vitro a biocompusilor activi a fost investigata pe modele experimentale specifice in vederea testarii: a) toxicitatii pe linii de celule umane standardizate, derivate din piele (HS-27 fibroblasti dermali si HaCaT keratinocite epidermale) pentru a identifica intervalul de doze citotoxice si pragul de raspuns viabil la nivel celular; b) in vitro a mecanismului de actiune a principiilor active – proliferativ prin analiza ciclului celular utilizand citometria in flux; antioxidant prin evaluarea stresului oxidativ: cuantificarea nivelului de radicali liberi (O.2 si H2O2) produs de celule prin citometrie in flux; anti-inflamator prin masurarea ratei de eliberare extracelulara a citokinelor pro-inflamatorii IL-6 si IL-8, activitatii  metaloproteinazelor MMP-2 si MMP-9 (zimografie) si nivelurilor de COX2 prin RT-PCR; viteza de migrare a celulelor dermice si epidermice sub actiunea matricei zeolit-extract vegetal-chitosan in scopul evidentierii efectului de regenerare tisulara la nivel cutanat c) efectului antimicrobian prin analiza microbiologica pe tulpini relevante de microorganisme.

4.2. Testarea eficacitatii la nivelul sistemului biologic prin aplicarea de modele preclinice: 

Pentru investigarea efectului biologic in vivo s-au efectuat studii preliminare (model CAM de oua embrionate, model plagi cronice si model acnee) pentru matricea de zeolit si extractele vegetale cuplate. Modelul CAM a fost utilizat in scopul selectarii principiile active in functie de proprietatile neovascularizante si neoformare de tesut. Efectele extractelor vegetale si grupurilor structurale matrice zeolit-extract-chitosan au fost testate ulterior pe sobolani, conform modelului de plagi cronice pe fond de diabet zaharat si modelului de inducere a acneei cu Propionibacterium acnes. Studiile se afla in desfasurare, rezultatele finale urmand sa fie incluse in etapa urmatoare de raportare.

      Analiza critica a activitatii biologice a materialelor cu extracte vegetale incarcate pe matricea zeolit-chitosan si a potentialului de interactiune la nivelul sistemului biologic se conchide astfel:

  • Testele de citotoxicitate efectuate au demonstrat ca materialele mezoporoase MCM-41 sinteza si comercial nu au efect citotoxic la nivelul fibroblastilor si keratinocitelor in cultura. Materialele cu extracte vegetale incarcate pe matricea zeolit-chitosan la concentratiile testate nu manifesta citotoxicitate;
  • Testele de eficacitate la nivelul sistemului biologic in vitro au evidentiat pentru compusii activi din cele 5 extracte vegetale incorporate in materialul mezoporos de sinteza o actiune proliferativa, antioxidanta, antiinflamatoare la nivel celular si molecular, regeneratoare celulara semnificativa la un timp prelungit de tratare a celulelor, comparativ cu extractele vegetale incorporate in materialul mezoporos comercial, ceea ce indica eliberarea lenta si sustinuta a unei doze eficace in vitro din matricea de sinteza;
  • Testele de evaluare a efectului antimicrobian pentru materialele cu extracte vegetale incarcate pe matricea zeolit-chitosan au identificat actiune antimicrobiana pe tulpini relevante in terapeutica afectiunilor acneice cutanate: Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa;
  • Testele de eficacitate la nivelul sistemului biologic in vivo au cuprins studii preliminare de investigatie si selectare a principiilor active din extractele vegetale in functie de actiunea biologica, precum si de analiza preliminara a efectului prototipului destinat terapiei plagilor cronice si prototipului destinat terapiei acneei.

5.Stabilirea designului prototipului. Evaluarea cedarii lente a principiilor active din sistem in diferite medii sintetice prin test de performanta in vitro

  • Stabilirea designului prototipului:

Stabilirea design-ului prototipului s-a concretizat in baza investigatiilor riguroase efectuate pentru complexul integrat inovativ zeolit MCM41 -chitosan-principii active, la nivelul sistemului biologic, in vitro si in vivo. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) s-a definit prin completarea actiunilor biologice ale grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-catina-chitosan. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) s-a proiectat prin combinatia optima a grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-menta-chitosan si MCM-41-musetel-chitosan. Prototipurile de produs au fost supuse evaluarii eficacitatii profilului de cedare lenta si sustinuta a principiilor active din matricea zeolit-chitosan  prin aplicarea de metodologii si tehnologii high-tech.

  • Evaluarea cedarii lente a principiilor active din sistem in diferite medii sintetice prin test de performanta in vitro – sistem de difuzie verticala:

Sistemul de difuzie verticala a principiilor active testate prin membrane sintetice, de polaritate similara cu a barierei epidermale umane isi dovedeste eficacitatea in transferul tehnologic de la nivel de laborator la nivel pilot a variantelor de formulare pentru produsele topice. La nivel de laborator se practica inglobarea principiilor active in diferite forme de conditionare prin incercarea mai multor variante de formulare tinand cont de aspectele fizico-chimice ale substantei active: solubilitate, stabilitate, coeficient de partitie in functie de care se aleg calitativ si cantitativ substantele care influenteaza stabilitatea produselor si viteza de eliberare a principiilor active din forma de conditionare. Pentru alegerea formulei de produs cu eficacitate inalta din punct de vedere al procentului de cedare a principiilor active ce urmeaza a fi introdusa in fabricatie la nivel pilot si apoi testata in vivo pe subiecti umani este imperios necesara testarea in prealabil prin sistemul de difuzie verticala a mai multor variante de formulare pentru acelasi produs, care interpretate comparativ sustin varianta potrivita pentru etapele urmatoare de investigare.

Pentru testarea cedarii lente a principiilor active din matricea zeolit-chitosan prin sistemul de difuzie verticala s-a conditionat prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC): MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-catina-chitosan sub forma de gel. Prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA): MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-menta-chitosan si MCM-41-musetel-chitosan s-a conditionat sub forma de masca.

Prototipurile de produs au fost supuse evaluarii eficacitatii profilului de cedare lenta si sustinuta a principiilor active din matricea zeolit-chitosan prin aplicarea de metodologii si tehnologii high-tech.

Testarea eliberarii lente a principiilor active cuplate cu matricea zeolit-chitosan din produsul topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA):

            S-au efectuat experimente in duplicat pentru produs topic pentru PA cu principii active incarcate pe MCM-41 comercial-chitosan si comparativ experimente in duplicat pentru produs topic pentru PA cu principii active incarcate pe MCM-41 sinteza-chitosan.

Analiza statistica (Student’s t–test for two samples), arata ca, eliberarea in celula si pe suprafata, cumulata, nu difera semnificativ statistic (p > 0,05) pentru  masca antiacneica referinta fata de masca antiacneica produs de sinteza, pentru fiecare din componentele dozate.

Testarea eliberarii lente a principiilor active cuplate cu matricea zeolit-chitosan din produsul topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC):

S-au efectuat experimente in duplicat pentru produs topic pentru PPC cu principii active incarcate pe MCM-41 comercial-chitosan si comparativ experimente in duplicat pentru produs topic pentru Ppc cu principii active incarcate pe MCM-41 sinteza-chitosan.

Analiza statistica (Student’s t–test for two samples), arata ca, eliberarea in celula si pe

suprafata,  cumulata, nu difera semnificativ statistic (p > 0,05) pentru gel pentru plagi referinta fata de gel pentru plagi produs de sinteza, pentru fiecare din componentele dozate.

  • Caracterizare fizico-chimica a prototipului si configuratie finala a prototipului

Caracterizarea fizico-chimică a prototipului:

Caracterizarea fizico-chimică a prototipului în variantele PPC și PA, a fost realizată atât prin metode clasice, cât și prin metode avansate spectrometrice și de imaging, în vederea obținerii unor informații relevante privind proprietățile acestuia. Complexitatea sistemului cu extracte vegetale încărcate în matricea de MCM41 și încapsulate în chitosan, a impus o abordare sistematică bazată pe elementele descrise în ST01 – ST08. Etapele succesive de caracterizare sunt:

  • caracterizarea materialului intermediar MCM41
  • caracterizarea materialelor intermediare cu extracte vegetale încărcate în MCM41 și încapsulate în chitosanului
  • caracterizarea prototipului în variantele PPC și PA

Caracterizarea materialului intermediar MCM-41:

În imaginile obținute prin TEM se confirmă o structură a materialului ce permite o încărcare mai eficientă, ca urmare a vitezei mai ridicate de difuziune în pori a materialului încărcat, precum și o accesibilitate difuzională mai ridicată în procesele de desorbție.

Analiza EDS a materialului intermediar MCM41 evidențiază prezența siliciului și a oxigenului, precum și absența altor elemente contaminante (benzile specifice pentru Cu provin din grila utilizată pentru introducerea probei).

Datele DLS sunt în bună concordanță cu observațiile experimentale SEM și TEM.

În spectrele IR ale materialelor de tip MCM41 sunt importante absorbțiile ce apar prin prezența grupărilor silanolice, absorbțiile specifice interacției cu atomii de siliciu din rețeaua siloxanică, precum și modificările ce apar în urma diverselor prelucrări fizice sau chimice.

Analiza FT-IR a materialelor finale după calcinare, pentru 5 dintre repetițiile realizate în aceleași condiții experimentale, evidențiază reproductibilitatea caracteristicilor de bază ale matericei de silice.

Graficele obținute pentru materiale cu suprafețe specifice cunoscute (determinate prin metoda BET), permit compararea cu referință MCM41 cu suprafață specifică certificată de producător. Metoda  adsorbția apei în fază de vapori a fost utilizată și în procesele de optimizare a sintezei MCM41, permițând selectarea rapidă a materialelor cu proprietăți superioare din punct de vedere a suprafeței specifice. Principalele avantaje ale metodei:

  • viteza de lucru mare;
  • costuri aferente reduse;
  • operare ușoară – poate fi realizată cu succes de către orice operator al balanței analitice.

Caracterizarea materialelor intermediare cu extracte vegetale încărcate în MCM41 și încapsulate în chitosan:

Materialele compozite pe bază de MCM41, încărcate cu extracte vegetale și încapsulate în chitosan: MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc au fost caracterizate prin FT-IR, prin obținerea profilului de desorbție, iar contaminanții anorganici au fost analizați prin ICP-OES.

Analiza FT-IR a materialelor încărcate cu extracte vegetale și încapsulate în chitosan, permite evidențierea caracteristicilor spectrale ale suportului de silice, ale chitosanului, respectiv amprenta specifică a extractului vegetal încărcat și încapsulat.

Pentru caracterizarea fizico-chimica a materialelor cu extracte vegetale încărcate în MCM41 și încapsulate în chitosan s-au efectuat si analize pentru detectia de reziduuri metalice prin tehnica ICP-OES si analiza de solventi reziduali. De asemenea, s-au analizat microbiogic materialele cu extracte vegetale încărcate în MCM41 sinteza și încapsulate în chitosan.

    Analiza de metale folosind tehnica ICP-OES:

    Metoda ICP reprezintă o alternativă modernă a metodei de spectrometrie de absorbţie atomică (AA), cu avantajul major al posibilităţii analizei simultane a tuturor elementelor din proba de analizat. Ca urmare, metoda poate fi aplicată practic oricărei probe ce se analizează prin AA. Analiza este simultană şi permite determinarea tuturor elementelor la o singură citire a probei.

    S-a calculat aportul de impuritati (metale grele) adus de fiecare material in cele 2 produse de uz topic, unul pentru plagi si unul anti-acneic. Considerand cantitatea teoretica de produs, pentru arsuri de extindere mica, mai mica de 1/3 din suprafata totala a corpului, expunerea relativa la fiecare dintre impuritatile dozate in produsul finit, este inferioara concentratiei permise pentru impuritati elementare la administrare parenterala (conform ICH).

    Cantitatea teoretica de produs, pentru aplicare pe fata, in 2 aplicatii /zi fiind de 24,14 mg/kg/zi, expunerea sistemica la fiecare impuritate dozata in produs, va fi inferioara valorilor calculate, intrucat absorbtia dermica este mult inferioara (exemplu: As 3%; Cd 1%; Pb 0,3%; Co 9,7%; Ni 3,5%; Ag 1%; Ba 10%; Cr 4%; Cu 0,3%; Sb 1%).

    Pentru  metalele precum Al, Na, K, Ca, Mg, Fe, Zn , B, Bi, nu este nevoie de o evaluare a riscurilor deoarece acestea sunt elemente cu o toxicitate foarte redusa, chiar si pentru concentratii mari.

    Determinarea continutului de metale grele din materiale mesoporoase sintetizate si incarcate cu extracte de plante utilizand spectrometria de absorbtie atomica (AAS):

     

    Spectrometria de absorbtie atomică (AAS) face parte din metodele optice UV-VIS şi se bazează pe măsurarea puterii radiante adsorbite de către o populaţie de atomi liberi. Mijloacele de evaporare şi atomizare, care s-au impus in AAS sunt flacăra şi evaporarea electrotermică. In cazul utilizării cuptorului de grafit avem spectrometrie de absorbţie atomică cu evaporare electrotermică (ET-AAS). AAS este capabil sa citeasca pe o singura lungime de unda selectata. Monocromatorul are rolul de izolare a benzii spectrale şi de poziţionare pe maximul linei analitice, emisă de lampa cu catod cavitar.

    Considerand cantitatea teoretica de produs, pentru arsuri de extindere mica, mai mica de 1/3 din suprafata totala a corpului, expunerea relativa la fiecare dintre impuritatile dozate in produsul finit, este inferioara concentratiei permise pentru impuritati elementare la administrare parenterala (conform ICH). Cantitatea teoretica de produs topic anti-acneic, pentru aplicare pe fata, in 2 aplicatii /zi fiind de 24,14 mg/kg/zi, expunerea sistemica la fiecare impuritate dozata in produs, va fi inferioara valorilor calculate, intrucat absorbtia dermica este mult inferioara.

      Concluzii analiza de metale grele:

    Datorita faptului ca dezagregarea probelor s-a facut diferit pentru cele 2 tehnici de determinare a metalelor (ICP-OES si AAS), pentru anumite elemente (Cu, Pb, Na, Mn) exista diferente de concentratii. Amestecul oxidant Acid azotic/Acid Clorhidric folosit la determinarile ICP nu este la fel de puternic precum amestecul Acid azotic/Acid florhidric/Acid percloric utilizat la determinarile AAS, prin urmare acesta din urma reusind sa sparga reteaua de siliciu in care sunt prinse metalele.

     

                Analiza de solventi reziduali a materialelor intermediare cu extracte vegetale încărcate în MCM41 și încapsulate în chitosan:

                S-au determinat prin metoda GC-MS cu HS (Headspace), prin care solventii reziduali sunt volatilizati si injectati direct in forma gazoasa. Concentratiile s-au determinat prin comparare prin metoda cu standard extern. Metanolul este incadrat in clasa 2 de toxicitate si are limita 3000 ppm, iar alcoolul etilic si acetona sunt incadrate in clasa 3 cu limita 5000 ppm (cf Farmacopea europeana, si USP).

                Caracterizarea prototipului in variantele PPC si PA:

                Prototipul, în variantele PPC și PA, constituit din materialele compozite pe bază de MCM41, încărcate cu extracte vegetale și încapsulate în chitosan: MIICa, MIISa, MIIHp, MIIMh, MIIMc, a fost caracterizat prin FT-IR și prin obținerea profilului de desorbție (este de remarcat, faptul că pentru caracterizarea prototipului este necesară parcurgerea ST01 – ST08, deci include toate analizele din secțiunile A, B și C de mai sus; în acest capitol sunt descrise numai analizele specifice care demonstrează caracteristicile suplimentare ale PPC și PA față de materialele individuale care intră în compoziția acestora).

                Analiza FT-IR a materialelor PPC și PA, permite evidențierea caracteristicilor spectrale ale suportului de silice, ale chitosanului, respectiv si a amprentei specifice a extractelor vegetale utilizate pentru prepararea acestora.

    Obtinerea profilului de desorbție pentru PPC și PA se realizează prin metoda HPLC modificată, în flux continuu, și permite evidențierea cantității de material desorbit. Pentru ambele materiale se constată o eliberare lentă a extractelor vegetale, fapt ce recomandă aceste materiale pentru aplicații de eliberare susținută.

    Configurație finală a prototipului:

    Componentele prototipului sunt reprezentate de doua produse medicamentoase/dispozitive medicale cu administrare topica, ce combina proprietățile materialelor zeolitice și ale chitosanului, cu principii active vegetale cu aplicații în terapia plăgilor cronice (PPC) și a acneei vulgaris (PA). Compozitul zeolit MCM41 – chitosan reprezintă un grup structural original, care oferă matricea optimă pentru încorporarea și eliberarea controlată și susținută a principiilor active, conferind în același timp protecția împotriva factorilor mediului în care sunt administrate, care ar putea duce la degradarea acestora.

    Activitatile etapei a doua de derulare a  proiectului au fost integral indeplinite si  concretizate astfel:

    • in scopul optimizarii potentialului terapeutic al grupului structural zeolit MCM41-chitosan-principii active, s-au obtinut extracte vegetale noi cu continut standardizat si inalt purificat in componente active (CAT2–extract uscat frunze de Salvia officinalis);
    • in plus fata de extractele obtinute in prima etapa de cercetare industriala, s-au aplicat solutii tehnologice suplimentare la nivel de laborator pentru exploatarea de noi resurse vegetale in scopul completarii spectrului de actiuni biologice cu aplicatii in patologiile propuse. Uleiul de catina, extras din fructele de Hippophae rhamnoides a fost introdus in studiu datorita continutului bogat in principii active valoroase pentru functia de regenerare tisulara.
    • S-a testat toxicitatea si actiunea compusilor biologic activi prin experimente in vitro:
    • Extractul uscat din frunze de Salvia officinalis (CAT2): efect de regenerare tisulara dermo-epidermala prin actiunea asupra fazei de sinteza S a fibroblastilor si keratinocitelor; efect antioxidant prin reducerea ambelor ROS intracelulare si efect cicatrizant prin rolul asupra expresiei moleculelor specifice diferentierii keratinocitelor.
    • Extractul hidroalcoolic 70% de Salvia officinalis: efect proliferativ, anti-oxidant, anti-inflamator la nivel epidermal si cicatrizant.
    • Extract uscat din Calendula officinalis (Dermo-Oz): efect de regenerare tisulara dermo-epidermala prin stimularea ciclului celular; efect antioxidant remarcabil prin anihilarea intracelulara a anionului de oxigen si peroxidului de hidrogen ce au efecte nocive asupra functionalitatii si integritatii celulare.
    • Extract hidroalcoolic 65% de Calendula officinalis-galbenele: potential in regenerarea dermica prin stimularea turn-overului celular, efect antioxidant, efect anti-inflamator la nivel epidermic, actiune cicatrizanta prin stimularea diferentierii keratinocitelor.
    • Extract hidroalcoolic 70% de Matricariae chamomilae-musetel: efect antioxidant, anti-inflamator si cicatrizant prin accelerarea turn-overului epidermal.
    • Extract hidroalcoolic 70% de Mentha spicata-menta: efect proliferativ asupra fibroblastilor si keratinocitelor, antioxidant, anti-inflamator si cicatrizant prin accelerarea turn-overului epidermal.
    • Uleiul extras din fructe de catinaHippophae rhamnoidesregenerarea dermica si epidermica prin stimularea turn-overului celular; efect cicatrizant si anti-oxidant remarcabil prin reducerea nivelului de ROS si anti-inflamator la nivel epidermic.
    • Formula optima pentru sustinerea eficacitatii grupului structural inovativ cuprinde 5 extracte vegetale: CAT2-extract uscat din frunze de Salvia officinalis; extract hidroalcoolic 65% de Calendula officinalis flos – galbenele; extract hidroalcoolic 70% de Matricariae chamomilla flos- musetel; extract hidroalcoolic 70% din Mentha spicata –menta; ulei din fructe de Hippophae rhamnoides.
    • Matricea zeolitica MCM41-sinteza s-a obtinut prin optimizarea tehnologiei de nivel TLR4 si prin aplicarea de metodologii de investigare critica a caracteristicilor specifice materialului mezoporos pe baza de siliciu.
    • Complexul incarcat si incapsulat MCM41 sinteza-extract vegetal-chitosan s-a realizat prin abordarea de solutii tehnologice optimizate si validate.
    • Investigatia critica a activitatii biologice a materialelor cu extracte vegetale incarcate pe matricea zeolit-chitosan si testarea potentialului de interactiune la nivelul sistemului biologic s-au conchis in:
    • Testele de citotoxicitate efectuate au demonstrat ca materialele mezoporoase MCM-41 sinteza si comercial nu au efect citotoxic la nivelul fibroblastilor si keratinocitelor in cultura. Materialele cu extracte vegetale incarcate pe matricea zeolit-chitosan la concentratiile testate nu manifesta citotoxicitate;
    • Testele de eficacitate la nivelul sistemului biologic in vitro au evidentiat pentru compusii activi din cele 5 extracte vegetale incorporate in materialul mezoporos de sinteza o actiune proliferativa, antioxidanta, antiinflamatoare la nivel celular si molecular, regeneratoare celulara semnificativa la un timp prelungit de tratare a celulelor, comparativ cu extractele vegetale incorporate in materialul mezoporos comercial, ceea ce indica eliberarea lenta si sustinuta a unei doze eficace in vitro din matricea de sinteza;
    • Testele de evaluare a efectului antimicrobian pentru materialele cu extracte vegetale incarcate pe matricea zeolit-chitosan au identificat actiune antimicrobiana pe tulpini relevante in terapeutica afectiunilor acneice cutanate: Staphylococcus aureus și Pseudomonas aeruginosa;
    • Testele de eficacitate la nivelul sistemului biologic in vivo au cuprins studii preliminare de investigatie si selectare a principiilor active din extractele vegetale in functie de actiunea biologica, precum si de analiza preliminara a efectului prototipului destinat terapiei plagilor cronice si prototipului destinat terapiei acnei.
    • Stabilirea design-ului prototipului s-a concretizat in baza investigatiilor riguroase efectuate pentru complexul integrat inovativ zeolit MCM41 -chitosan-principii active, la nivelul sistemului biologic, in vitro si in vivo:
    • prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia plagilor cronice (PPC) s-a definit prin completarea actiunilor biologice ale grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-catina-chitosan;
    • prototipul de produs topic cu aplicatii in terapia acneei vulgaris (PA) s-a proiectat prin combinatia optima a grupurilor structurale: MCM-41-CAT2-chitosan, MCM-41-galbenele-chitosan, MCM-41-menta-chitosan si MCM-41-musetel-chitosan.
    • Prototipurile de produs au fost supuse evaluarii eficacitatii profilului de cedare lenta si sustinuta a principiilor active din matricea zeolit-chitosan prin aplicarea de metodologii si tehnologii – sistem de difuzie verticala – care au dovedit un profil de eliberare lenta si sustinuta a principiilor active din produsele topice.
    • Configuratia finala a prototipului de produs a fost riguros caracterizata fizico-chimic si microbiologic si validata pe fluxul tehnologic de sinteza si cuplare cu principiile active si chitosan in scopul obtinerii unui material standardizat calitativ si cantitativ, ieftin si reproductibil pentru a fi ulterior transferat la nivel pilot prin ridicarea la scara a tehnologiilor de sinteza.